Southern blot là gì

     

phương thức lai Southern blot là cách thức lai thân DNA của tế bào với mẫu mã dò DNA. Phương thức này cho phép nghiên cứu giúp DNA của bộ gen, kiểm tra kết quả chuyển ren hoặc kiểm soát sự có mặt của một gene nào đó trong bộ gen của tế bào.Southern blot - một kĩ thuật đa số trong vấn đề phân tích kết cấu của gene, được cải cách và phát triển vào giữa thập niên 1970 bởi vì Edwin Southern sinh hoạt MRC một cỗ phân của genome động vật hoang dã hữu nhũ sinh sống Edinburgh (Southern, 1975).




Bạn đang xem: Southern blot là gì

*
21 trang | phân chia sẻ: superlens | Lượt xem: 5257 | Lượt tải: 8
*



Xem thêm: Voltage Regulator Là Gì - Đây Là Một Thuật Ngữ Kỹ Thuật Và Công Nghệ

Bạn vẫn xem trước đôi mươi trang tư liệu Phương pháp southern blot, giúp thấy tài liệu hoàn hảo bạn click vào nút download ở trên


Xem thêm: Kính Khoáng Là Gì - Mặt Kính Mineral Crystal Có Xước Không

GVHD:Trần Thị DungSVTH:Nguyễn Thị Hoàng Yến61103239Nguyễn Văn Cư61103020Huỳnh Thị Mai Thy61103315MÔN KỸ THUẬT DI TRUYỀNPHƯƠNG PHÁP SOUTHERN BLOTMục lục:I. Reviews về cách thức Southern blot.II. Nguyên lý và nguyên tắc.1.Nguyên lý.2.Nguyên tắc.III. Chế tạo ra mẫu dò.1.Tạo mẫu mã dò dựa vào Plasmid2.Tạo Probe nhờ vận dụng PCR3.Đánh dấu ProbeIV. Các bước của cách thức Southern Blot.1.Giai đoạn 1.2.Giai đoạn 2.3.Giai đoạn 3.V. Ứng dụng.Giới thiệu về phương thức Southern blotPhương pháp lai Southern blot là phương pháp lai thân DNA của tế bào với mẫu dò DNA. Cách thức này được cho phép nghiên cứu giúp DNA của cục gen, kiểm tra kết quả chuyển gen hoặc bình chọn sự xuất hiện của một gene nào kia trong cỗ gen của tế bào.Southern blot - một kĩ thuật chủ yếu trong việc phân tích cấu tạo của gene, được cải cách và phát triển vào thân thập niên 1970 do Edwin Southern ở MRC một cỗ phân của genome động vật hoang dã hữu nhũ sinh sống Edinburgh (Southern, 1975). Edwin Southern cách thức Southern Blot được xúc tiến nhờ một trong những kỹ thuật nền tảng của công nghệ sinh học phân tử như:Tách phân tách genPCRThẩm tích những phân tử acid nucleotide lên màng laiLai phân tử (lai với mẫu dò quánh hiệu)Đến nay, nghệ thuật lai Southern sẽ được cách tân đi hết sức nhiều, đa phần bao gồm: tăng cường độ nhạy Giảm một trong những bước trong quá trình laiGiảm thời gian thực hiện Vẽ kinh nghiệm ngày nay đơn giản dễ dàng hơn rất nhiều.II. Nguyên tắc và Nguyên tắcIII. Tạo ra mẫu dò (probe)Tạo mẫu dò nhờ PlasmidCắt plasmid cùng DNA đã bóc tách chiết từ bỏ tế bào bởi cùng một một số loại enzyme.Gắn DNA vào plasmid trong điều kiện môi trường phù hợp.Thực hiện đổi thay nạp vào trong tề bào vi khuẩn.Nhân các tế bào vi kuẩn và lựa chọn lọc.Tách plasmid từ các tế bào lựa chọn lọc.Tách mẫu mã dò (đoạn DNA).Đánh dấu mẫu mã dò.Tạo Probe nhờ ứng dụng PCRThiết lập mồi và ghi lại phóng xạ vào những mồi.Biến tính mẫu mã DNA thành các sợi đơn.Gắn mồi vào những sợi đơn.Tổng hợp những sợi DNA mới.Biến tính để bóc tách các chuỗi bắt đầu vừa tổng hợp thành các sợi đơn.tiếp tục quay về gắn mồi vào những sợi đơn.Đánh dấu mẫu dòGồm có 4 phương pháp:Phương pháp Nick-translationPhương pháp random primingPhương pháp lưu lại các oligonucleotidePhương pháp chế tác mẫu dò RNA (riboprobe)Phương pháp Nick-translationDNAse I tạo các khía trên DNA ở những vị trí bỗng nhiên khác nhau.DNA polymerase cùng với hoạt tính exonuclease 5’-3’, giảm mạch DNA theo hướng 5’-3’ theo những khía đã tạo sẵn, đồng thời, tổng thích hợp bù đoạn thiếu với sự tham gia của nucleotide khắc ghi (thường là dATP)Kết quả là DNA được tiến công dấu.Phương pháp random primingDNA kép được vươn lên là tính bởi nhiệt thành 2 mạch đơn.Hỗn hợp những oligonucleotide tổng hợp được thêm vào, trở thành mồi (primer) mang đến DNA polymerase tổng phù hợp mạch bổ sung.Một trong 4 nhiều loại nucleotide bổ sung cập nhật vào được đánh dấu, buộc phải 2 mạch new tổng hợp cũng khá được đánh dấu.3. Cách thức đánh dấu những oligonucleotideCác oligonucleotide được tổng hòa hợp dưới dạng mạch đối chọi rồi được ghi lại ở đầu 5’ dựa vào enzyme T4 polynucleotide kinase cùng với sự hiện diện của một nucleotide tấn công dấu. Sau phản bội ứng các nuclotide trường đoản cú do cũng rất được loại bỏ bằng sắc kí lọc gel, nhan sắc kí lỏng cao áp (HPLC),4. Phương pháp tạo mẫu dò RNA (riboprobe)Trước hết, trình từ bỏ DNA dùng để sản xuất mẫu dò RNA buộc phải được đưa vào trong 1 vector bao gồm mang các promoter.Vector này được cắt ra thành dạng mạch thẳng; sau đó, RNA polymerase thích hợp được sản xuất phản ứng cùng với những nucleotide tiến công dấu.RNA polymerase sẽ phiên mã trình từ DNA ban đầu từ promoter, tạo ra một lượng khủng RNA đánh dấu.Sau bội nghịch ứng, vector gồm mang trình từ DNA gốc bị DNase I phân hủy, các enzyme được sa thải qua bóc tách chiết bằng phenol cùng RNA được tinh sạch mát trên dung nhan kí lọc gel.IV.Quy trình của cách thức Southern blotGiai đoạn 1Giai đoạn 2Chuyển DNA vừa biến chuyển tính lên màng lai (màng nylon hoặc nitrocellulose). Nguyên lý của quá trình:Là sự mao dẫn của dung môi (thường là NaOH/NaCl)qua lớp gel từ nơi có thế nước gánh vác nơi có thế nước thấp, sở hữu theo DNA gắn lên màng lai được bố trí ngay bên trên lớp gel.Quá trình này diễn ra trong một vài giờ hoặc rất có thể dùng thiết bị thấm hút chân không.Tương tác ion giữa màng lai (tích năng lượng điện dương) cùng DNA (tích năng lượng điện âm) tạo nên lực hút, đính thêm kết các DNA lên màng lai.Trong quy trình chuyển, vị trí các DNA không gắng đổi.Màng lai sau quá trình trên, được cách xử lý nhiệt (800 vào 2 giờ) hoặc chiếu tia UV (vài phút) để cố định DNA bên trên màng.Cách tiến hành:Đặt gel lên giá gửi máy Bloting để gửi nguyên vẹn các sợi DNA thay đổi tínhDung dịch dẫn chuyển là NaOH 0.4MMàng lai sẽ lưu lại cố dịnh các đoạn DNA được đưa lên từ gel điện liGiai đoạn 3IV.Ứng dụngSouthern blot được thực hiện để đánh giá bạn dạng copy của ren trong genome, xác minh các intron, exon, các đoạn bị thốt nhiên biến thêm hoặc mất đoạnKhi sử dụng các DNA marker khác nhau làm mẫu dò, có thể phân biệt được các loài, những loài đồng hình.Southern blot – RFLP : góp phát hiện tại sự nhiều chủng loại chiều dài những đoạn cắt do RE, qua đó, phân biệt sai biệt di truyền ở vị trí nhận ra của các RE dẫ mang đến sai biệt vào chiều dài của những đoạn DNA tạo nên từ RE đó. Đòng thời RFLP còn sử dụng để xác định huyết thống, lập bạn dạng đồ số lượng giới hạn gene.Truy kiếm tìm tội phạm nhờ vào dấu vết hiện trường.Chuẩn đoán bệnh thai nhi.Tài liệu tham khảo:Sinh học phân tử - hồ nước Huỳnh Thùy Dươngwww.Wikipedia.orgTHE END THANKS FOR WATCHING !